一、羥脯氨酸提?。?/div>
1. 組織:取約0.5g 樣品于玻璃管,加入5mL 的組提取液,置于110℃烘箱,水解6 至12 小時,16000rpm,25℃,
離心20min,用提取液定容至5mL,取上清待測。
2. 細胞:取約500 萬個細胞,加入2mL 的細胞提取液,于高壓消毒器中15 磅保持30min,自然降壓后待測。
二、測定操作:
對照管測定管
樣本(mL) 0.2
試劑一(mL) 0.2 0.2
混勻,室溫靜置20min
試劑二(mL) 0.2 0.2
H2O(mL) 0.6 0.4
混勻,60℃,20min,取出后室溫靜置15 min,測定A560。(A560=A 測定-A 對照)
羥脯氨酸含量計算:
標準曲線:y=64.875x+ 0.0251,R2=0.9991
(1)按組織計算
HYP 含量(mg/g) =(A560-0.0251)÷64.875×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×W)
=0.385×(A560-0.0251)÷W
(3)按細胞計算:
HYP 含量(mg/104cell)= (A560-0.0251)÷64.875×V 反總÷V 樣×V 樣總÷細胞數量(萬個)
=0.154×(A560-0.0251)÷細胞數量(萬個)
V 反總:反應體系總體積,1mL; V 樣:反應中樣本體積,0.2mL;V 樣總:加入提取液體積,mL; W:
樣本質量,g。
注意事項:
1、OD 值大于0.8,樣品適當稀釋再測定,注意計算公式里乘以稀釋倍數。
2、試劑有一定的毒性,請操作時做好防護措施,防止吸入或與皮膚接觸。