游離脂肪酸（FFA）含量試劑盒（測血清、動物組織、微生物、細胞） 微量法 100 管/96 樣 正式測定務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定 測定意義： 游離脂肪酸，也稱為非酯化脂肪酸，在與白蛋白結合的血漿中循環。動物血液中的游離脂肪 酸 (FFA )含量是一項重要的生理生化指標。血清中游離脂肪酸的濃度與脂類代謝、糖代謝、 內分泌功能有關，游離脂肪酸的濃度會因為糖尿病、重癥肝障礙、甲狀腺功能亢進等疾病而 上升。 測定原理： 用有機溶劑萃取 FFA。含有 FFA 的有機液與三乙醇胺銅反應,在有機相中形成脂肪酸銅 (銅 皂) FFA 一 Cu。Cu 離子與顯色液反應形成紫紅色絡合物。反應形成的顏色深淺與 Cu 離子 濃度的關系符合朗伯一比爾定律，因此可利用此反應進行比色。 酶標儀、離心機、可調式移液器、96 孔板、蒸餾水。 試劑的組成和配制： 萃取液：液體 120 mL×1 瓶，4℃保存； 試劑一：液體 15 mL×1 瓶，4℃保存； 試劑二：液體 15 mL×1 瓶，4℃保存； 試劑三：粉劑×1 瓶，室溫保存； 試劑四：液體 12 mL×1 瓶，4℃保存； 樣本處理： 1.動物組織：按照動物組織質量（g）：萃取液 mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組 織，加入 1mL 萃取液），進行冰浴勻漿。震蕩提取 15min，5000 rpm 4℃離心 5min，取有 機相待測。 2.血清：吸取 50 μL 血清樣本，加入 1 mL 萃取液，震蕩提取 15 min 后，4℃，5000 rpm 離 心 5 min，取有機相待測。 3.微生物、細胞：按照細胞數量（104 個）：萃取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建 議 500 萬細胞加入 1 mL 萃取液）加入萃取液，冰浴超聲波破碎細胞（功率 300w，超聲 2 ，間隔 3 ，總時間 3min）；震蕩提取 15 min，然后 5000 rpm 4℃離心 5min，取有機相 待測。 注意：有機相待測液可能存在于上層，也可能存在于下層，注意觀察，體積較多的那一層 即為有機相待測液。 測定步驟： 1、 酶標儀預熱 30min 以上，調節波長至 550 nm。 2、 工作液的配制：臨用根據用量按照試劑一（V）：試劑二（V）：試劑三（m）=1（mL）： 1（mL）：0.66（g）的比例充分混勻。（注意：現用現配，用多少配多少，在空瓶中配 制，試劑盒中帶有 4 個空瓶，先將試劑一與試劑二混合，后再加入試劑三粉劑） 3、測定管：吸取600μL樣本，加入200μL工作液，蓋緊后震蕩20 min，4℃，5000 rpm離 心5 min，分層后取200μL上層有機相，加入100μL試劑四，搖勻，10 min后測定550 nm的 吸光值，記為A測定。 4、空白管：吸取600μL萃取液，加入200μL工作液，蓋緊后震蕩20 min，4℃，5000 rpm離心5 min，分層后取200μL上層有機相，加入100μL試劑四，搖勻，10 min后測定550 nm的 吸光值，記為A空白。 空白管只需測一次?！?/span>A=A測定-A空白 注意：1、有機溶劑易揮發，加入96孔板后應盡快檢測。 2、測定管中加入的樣本即樣本處理中的有機相待測液。 FFA 含量計算： 標準曲線：y = 0.0161x - 0.0141 R2 = 0.9985 x：棕櫚酸標準品濃度（nmol/mL） y：吸光值差值△A 1、血清 FFA 含量計算： FFA 含量(μmol/mL)=(△A+0.0141)÷0.0161×V1÷(V3×V1÷V2)÷1000 =1.242×(△A+0.0141) 2、動物組織、微生物、細胞中 FFA 含量計算： （1）按樣本蛋白濃度計算 FFA 含量(μmol/g 鮮重)=(△A+0.0141)÷0.0161×V1÷（W×V1÷V2）÷1000 =0.062×(△A+0.0141)÷W （2）按樣本蛋白濃度計算 FFA 含量(μmo/mg prot)= (△A+0.0141)÷0.0161×V1÷(V1×Cpr)÷1000 =0.062×(△A+0.0141)÷Cpr V1：加入樣本體積，0.6mL；V2：萃取液體積，1mL；V3：加入血清（漿）體積，0.05 mL； Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：動物組織樣品質量，g； 1000：1 μmol=1000 nmol 。 注意事項： 1. 蛋白含量不可直接用萃取液提取的有機相待測液直接測定，可用蒸餾水或緩沖液或生理 鹽水選用本公司的 BCA 法蛋白含量測定試劑盒。 2. 低檢出限為 20 nmol/mL。 |
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