免疫熒光實驗代測服務-億迅億迅

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在同一組織細胞標本上需要同時檢測兩種抗原時，需進行雙重熒光染色。雙重免疫熒光標記法(double immunofluorescence labeling method)也分為直接法和間接法。

服務說明

冰凍切片熒光tunel+免疫熒光雙標實驗步驟

1、 冰凍切片固定：冰凍切片從冰箱拿出來復溫，晾干水分，冷丙酮固定10min，待丙酮完全干后于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

2、 修復：切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止液體流走），在圈內滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K儲存液用PBS 1:9稀釋）覆蓋組織，37度溫箱孵育30min。將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

3、 破膜：切片稍甩干后在圈內滴加破膜工作液覆蓋組織，常溫下孵育20min，將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

4、 加試劑1,2：按片子數量和組織大小取tunel試劑盒內適量試劑1 (TdT) 和試劑2(dUTP)按2:29混合（試劑1,2為現配現用），加到圈內覆蓋組織，切片平放于濕盒內，37℃恒溫孵育2小時，濕盒內加少量水保持濕度。

5、 BSA封閉:將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min，在圈內滴加用3%BSA均勻覆蓋組織，室溫封閉30min。

6、 加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS按一定比例配好一抗，切片平放于濕盒內4°C孵育過夜。（濕盒內加少量水防止抗體蒸發）

7、 加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加與一抗相應種屬二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min。

8、 DAPI復染細胞核：切片用PBS（PH7.4）洗滌3次，每次5min。去除PBS后在圈內滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。

9、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

10、 鏡檢拍照：切片于尼康倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。（紫外激發波長330-380nm，發射波長420nm；FITC綠光激發波長465-495nm，發射波長515-555 nm；CY3紅光激發波長510-560，發射波長590nm）

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石蠟切片熒光tunel+免疫熒光雙標實驗步驟

1、 石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ15-20min-二甲苯Ⅱ15-20min-無水乙醇Ⅰ10min-無水乙醇Ⅱ10min-95%酒精5min-90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸餾水洗（冬天脫蠟時間稍微延長）。

2、 修復：切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止液體流走），在圈內滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K儲存液用PBS 1:9稀釋）覆蓋組織，37度溫箱孵育30min。將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

3、 破膜：切片稍甩干后在圈內滴加破膜工作液覆蓋組織，常溫下孵育20min，將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

4、 加試劑1,2：按片子數量和組織大小取tunel試劑盒內適量試劑1 (TdT) 和試劑2(dUTP)按2:29混合，加到圈內覆蓋組織，切片平放于濕盒內，37℃恒溫箱孵育2小時，濕盒內加少量水保持濕度。

5、 BSA封閉:將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min，在圈內滴加用3%BSA均勻覆蓋組織，室溫封閉30min。

6、 加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS按一定比例配好一抗，切片平放于濕盒內4°C孵育過夜。（濕盒內加少量水防止抗體蒸發）

7、 加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加與一抗相應種屬二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min。

8、 DAPI復染細胞核：切片用PBS（PH7.4）洗滌3次，每次5min。去除PBS后在圈內滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。

9、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

10、 鏡檢拍照：切片于尼康倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。（紫外激發波長330-380nm，發射波長420nm；FITC綠光激發波長465-495nm，發射波長515-555 nm；CY3紅光激發波長510-560，發射波長590nm）

免疫熒光實驗代測

注意事項

1、熒光染色后一般在1h內完成觀察，或于4℃保存4h，時間過長，可能會使熒光提前衰退。

2、每次試驗均需設置以下三種對照：

(1) 陽性對照：陽性血清+熒光標記物;

(2) 陰性對照：陰性血清+熒光標記物;

(3) 熒光標記物對照：PBS+熒光標記物。

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